2023年新年伊始，国际知名学术期刊Clinical and Translational Medicine (IF 8.55, JCR: Q1)在线发表了广州医科大学附属第一医院、国家呼吸医学中心、国家呼吸系统疾病临床医学研究中心何建行/梁文华教授团队联合广东技术师范大学卢旭教授团队在肺癌微环境领域的最新研究成果，题为“Multiplex immunofluorescence and single-cell transcriptomic profiling reveal the spatial cell interaction networks in the non-small cell lung cancer microenvironment ” (1)的研究。其中，何建行/梁文华教授团队的彭浩欣、吴相荣、贺苗医生，卢旭教授团队刘少鹏博士为第一作者。

    研究团队基于多重免疫荧光（Multiplex immunofluorescence, mIF）图像开发了一套肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中细胞互作网络的分析框架，全面揭示了免疫细胞和肿瘤细胞的空间分布特征及其之间复杂的通讯网络，为理解 TME中免疫调控及肿瘤进展机制提供了重要的见解。

研究背景

    TME包含癌细胞和多种基质细胞，包括免疫、血管和间质等细胞类群，以及相关趋化因子和细胞因子，癌细胞与各种细胞亚群之间复杂的相互作用对于其发生发展、侵袭转移等演变过程至关重要。而细胞的空间分布关系，是彼此间发生相互作用的前提及重要影响因素。越来越多的研究证据表明，除了细胞的数量和类型外，细胞的空间分布结构与肿瘤的治疗响应和患者预后密切相关。因此，探究TME中细胞间通讯网络对于理解肿瘤的演进机制以及开发新的肿瘤免疫治疗手段具有重要价值。

    此前，何建行/梁文华教授团队曾在EClinicalMedicine (IF: 17.03) (2)、Front Immunol (IF: 8.79) (3)、Transl Lung Cancer Res (IF：4.73) (4) 等期刊发文，对非小细胞肺癌微环境成分构成和异质性进行了探究，并揭示了CD8+ T细胞、巨噬细胞及其亚群等各类细胞的含量对预后就免疫治疗疗效的指示意义。本次研究则从各类细胞空间分布距离及聚集度的角度发现了新的规律。

研究队列与分析方法

1. 纳入533例于2009年至2011年期间在广州医科大学附属第一医院行肺叶切除/亚肺叶切除及淋巴结清扫术的IA~IIIB期非小细胞肺癌患者，结局指标为无病生存期 (disease-free survival, DFS)。

2. 采用mIF技术平台对原发肿瘤病灶的10种免疫靶标，包括CD4、CD38、CD66b、FOXP3、CD20、CD8、PD-L1、CD163、CD68、CD133的数量、密度、百分比及空间位置（癌巢/基质）进行检测。

3. 基于DAPI染色切片，采用StarDist深度学习模型对细胞核进行识别、分割与定位，获取细胞的空间坐标，并与基于mIF切片提取的染色区域坐标取交集，从而在一张切片上同时获取多种细胞类群的空间分布参数

4. 利用Delaunay三角剖分算法将空间邻近的细胞相连，以细胞间连线数目与细胞间连线距离衡量细胞的空间互作关系

5. 基于单细胞测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据揭示细胞间通讯网络，并采用基因集差异分析和基因集富集分析评估下游信号通路活性变化

研究结果

1. 多种细胞类群间存在密切的空间分布关系

（1）CD20+ B细胞，CD4+ T 细胞和CD38+ T细胞的空间分布呈显著正相关 (r2 = 0.41)；

（2）CD133+肿瘤干细胞、PD-L1+细胞和巨噬细胞的空间分布呈显著正相关 (r2 = 0.32)；

（3）调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg）的空间分布与CD20+ B细胞和CD38+ T细胞的分布呈显著负相关 (r2 = -0.45)

图1. 细胞间的空间分布关系

2. 复发者与非复发者TME细胞空间分布存在显著差异

（1）与非复发者相比，复发者CD133+肿瘤干细胞间空间分布更为紧密

（2）与非复发者相比，复发者中性粒细胞之间距离、CD4+ T细胞与中性粒细胞间距离、CD20+ B细胞与中性粒细胞间距离、CD38+ T细胞与中性粒细胞间距离显著较远，难以产生互作。

图2. 在复发患者和非复发患者间的细胞空间分布比较

3. 细胞的空间分布具有显著的预后指示意义

（1）CD8+ T细胞间的空间邻近与显著较长的DFS相关

（2）CD133+ 肿瘤干细胞间的空间邻近与显著较短的DFS相关

（3）CD4+ T细胞与CD20+ B细胞、CD4+ T细胞与中性粒细胞、CD20+ B细胞与中性粒细胞间的空间远隔与显著较短的DFS相关

图3. 细胞空间分布的预后指示意义

4. 整合细胞含量和空间分布参数构建并验证预后模型

（1）癌巢内巨噬细胞、CD8+CD133+ T细胞的含量，基质内CD4++ T细胞、CD8+ T细胞、PD-L1+细胞的含量，CD133+ 肿瘤干细胞间连接数目、CD8+ T细胞间连接数目，CD4+ T细胞与CD20+ B细胞间距离、CD4+ T细胞与中性粒细胞间距离、CD20+ B细胞与中性粒细胞间距离是稳健的预后因素

（2）免疫相关风险模型可有效预测非小细胞肺癌复发风险

图4. 建立和验证免疫相关风险模型

5. 鉴于中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞间的空间分布与预后密切关联，研究团队进一步对其背后的生物学机制进行了探究，发现

（1）肿瘤原发灶内中性粒细胞依据其转录特征可大致分为三个亚群，分别为经典亚型（高表达典型的中性粒细胞标记物，如S100A8和S100A9）、N1样亚型（高表达趋化因子和细胞因子标记物如CCL3、CCL4和抗原呈递标记物如HLA-DMB、CD74）、N2样亚型（高表达免疫抑制标记物如TGFBI、LAGLS3和促血管生成标记物如MMP9）

（2）配受体分析提示N1样亚群表现出促进T和B淋巴细胞增殖和活化信号的增加，而N2样亚群表现出抑制信号的增强

（3）功能分析表明IFN-α和IFN-γ信号通路在驱动N1样和N2样中性粒细胞之间的功能差异发挥了重要作用

图5. 中性粒细胞与其他细胞间的通讯网络

6. 鉴于巨噬细胞为预后不良的高危因素，研究团队进一步研究了可能的生物学机制，发现

（1）巨噬细胞表现出对T、B淋巴细胞抑制信号的增强。同时，参与肿瘤血管生成的刺激信号，如VEGFA-VEGFR2和VEGFB-VEGFR1，以及与肿瘤细胞互作信号如SPP1-CD44亦增强

（2）功能分析提示巨噬细胞相关基因在负调控免疫效应和血管生成过程中富集

图6. 巨噬细胞相关基因的富集分析

7. 最后，基于细胞空间分布、受体-配体和下游功能分析的综合研究结果，研究团队提出TME中免疫细胞和肿瘤细胞之间的交互模型，其中

（1）A模式表现为CD4+ T细胞、CD20+ B细胞和N1样中性粒细胞之间的空间混合分布结构。空间邻近的N1样中性粒细胞可以促进T和B淋巴细胞的增殖和激活。这种空间模式与更长的DFS相关

（2）B模式以免疫效应细胞间远隔分布为特征，可观察到更多的Treg，且中性粒细胞与CD4+ T细胞和CD20+ B细胞之间的距离更长。这种空间模式与较短的DFS相关

（3）C模式中CD8+T细胞与肿瘤细胞空间分隔，CD8+T细胞彼此之间紧密分布并密切联系。这种空间模式与更长的DFS相关

（4）D模式中CD8+ T细胞分散在肿瘤细胞之中，并靠近M2巨噬细胞分布。空间邻近的M2巨噬细胞可以抑制T淋巴细胞的活化。这种空间模式与较短的DFS有关。

总结与展望

    来自何建行/梁文华团队的系列研究，对肺癌微环境内细胞组成异质性和空间分布异质性进行了系统的剖析，并初步解码了细胞间的通讯网络，识别了与临床预后密切相关的几种细胞分布模式，为理解 TME中免疫调控及肿瘤演进机制提供了重要的见解。研究团队计划进一步对新辅助/辅助免疫治疗过程中TME内细胞组成和空间分布的动态变化进行探究，阐明各种细胞类群以及细胞外基质之间在各种层面和尺度上的相互调控和交流机制。

参考文献

1. Peng H, Wu X, Liu S, He M, Xie C, Zhong R, et al. Multiplex immunofluorescence and single-cell transcriptomic profiling reveal the spatial cell interaction networks in the non-small cell lung cancer microenvironment. Clin Transl Med. 2023;13(1):e1155.

2. Li F, Li C, Cai X, Xie Z, Zhou L, Cheng B, et al. The association between CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes and the clinical outcome of cancer immunotherapy: A systematic review and meta-analysis. EClinicalMedicine. 2021;41:101134.

3. Peng H, Wu X, Zhong R, Yu T, Cai X, Liu J, et al. Profiling Tumor Immune Microenvironment of Non-Small Cell Lung Cancer Using Multiplex Immunofluorescence. Front Immunol. 2021;12:750046.

4. Wu X-R, Peng H-X, He M, Zhong R, Liu J, Wen Y-K, et al. Macrophages-based immune-related risk score model for relapse prediction in stage I-III non-small cell lung cancer assessed by multiplex immunofluorescence. Transl Lung Cancer Res. 2022;11(4):523-42.

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